Laboratorio 12: Enzimas de Restricción y Electroforesis de DNA

Modificado de preparación de laboratorio por:   Omayra Rivera Denizard e

         Idaris de Jesús Maldonado

 

 

Enzimas de Restricción

 

·        Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas que cortan los enlaces fosfodiester del material genético a partir de una secuencia que reconocen.

 

·        Las mismas permiten cortar DNA de hebra doble, donde reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas direcciones).

 

 

·        Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la célula.  Las bacterias tienen la capacidad de metilar su DNA, lo cual sirve para distinguir entre el DNA extraño y el DNA propio.  Las enzimas de restricción no pueden cortar DNA metilado, de este modo solo afectan el DNA extranjero y no el DNA bacterial.

 

·        Existen 3 tipos de enzimas de restricción:

 

 

1.      Tipo I y Tipo III:

a.      Tienen actividad de restricción (cortan) y modificación (metilan).

b.      Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I cortan lejos de la secuencia de reconocimiento, ya sea río arriba o río abajo.  Las Tipo III cortan de 5-8 bases antes o despúes de la secuencia que reconocen.

c.      Necesitan ATP para moverse a través de la molécula de DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio del corte.

 

2.         Tipo II:

a.      Sólo tienen actividad de restricción.

b.      Cortan de manera consistente y predecible dentro de la secuencia que reconocen.

c.      Sólo requieren Mg++ como cofactor.

d.      No necesitan ATP.

 

·        Aplicaciones de las enzimas de restricción:

1.      Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

2.      Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.

3.      Generación de fragmentos para ser usados  como sondas marcadas en “Southern”y “Northern” blotting.

4.      Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA recombinante.

 

·        Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de donde se aisló por primera vez esta enzima.  La primera letra representa el género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han aislado de esa cepa.  Ej:

 

Eco RI à   E = género Escherichia

                   co = especie coli

                   R = cepa RV 13

                    I = primera endonucleasa aislada de esta cepa

 

·        Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:

 

1.  Cohesivos o pegajosos:

 

 


       GAATTC                       GGATCC                      AAGCTT

       CTTAAG                       CCTAGG                      AACGAA

          

EcoRI                           BamHI                          HindIII

 

2.      Abruptos:

 


      

        AATATT                       CCCGGG                      

        TTATAA                       GGGCCC

 

           SspI                               SmaI

 

·        Existen varios factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y que pueden afectar la actividad de las mismas:

1.      Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la endonucleasa.

2.      Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su estabilidad y actividad.

3.      DNAsas – Las DNAsas degradan el DNA en presencia de Mg++ .

4.      Contaminantes con carga (-).

5.      DNA contaminado con otro DNA.

6.      Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.

7.      Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de restricción no va a estar accesible para la enzima).

8.      Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones óptimas.

 

·      Importante:  Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para cortar 1µg de DNA en 1 hora.

 

·      El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión.

 

 

Electroforesis de DNA

 

·        La electroforesis es cuando moléculas cargadas son forzadas a ir a través de una matriz debido a un flujo de corriente eléctrica.

 

·        Una molécula de DNA cortada con enzimas de restricción genera diferentes fragmentos.  Estos pueden ser separados en base a su tamaño utilizando un gel de electroforesis.

 

·        El gel puede estar hecho de agarosa o poliacrilamida:

 

v     La agarosa es un polisacáriso de galactosa y derivados de galactosa que se entrecruzan por puentes de hidrógeno.  Se puede variar el tamaño de los poros ajustando la concentración de agarosa.

v     Los geles de poliacrilamida son generados al mezclarse polímeros de acrilamida y bisacrilamida en una reacción catalizada por persulfato de amonio y TEMED.  El tamaño de los poros depende de la concentración de acrilamida y bisacrilamida.

v     La matriz de poliacrilamida posee poros mas pequeños que la de agarosa, permitiendo la separación de fragmentos mas pequeños.

 

·        Los fragmentos de DNA migrarán a una razón inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular.

 

v     A mayor tamaño menor será la migración del fragmento y a menor tamaño mayor será la migración del fragmento.

 

·        El movimiento de los fragmentos de DNA va a producir un patrón de bandas, donde cada banda corresponde a un fragmento de un tamaño particular.

v     El tamaño de cada fragmento puede ser determinado utilizando un marcador o  una escalera de DNA cuyos fragmentos tienen pesos moleculares conocidos.

v     Este marcador sirve de control y migrará paralelo a las bandas de DNA que deseamos analizar.

 

·        Una mezcla de diferentes moléculas puede ser separada en base a

 

v     Tamaño de la molécula o masa.

v     Forma o conformación del DNA (ej. DNA superenrollado migra mas que DNA lineal).

v     Tamaño de los poros del gel.

v     Magnitud de la carga neta de la molécula.

 

·        Bajo condiciones fisiológicas los grupos fosfatos de los ácidos nucleicos son ionizados y migrarán al electrodo positivo (ánodo) cuando se colocan en presencia de un campo eléctrico.

 

v     La carga neta del DNA es negativa (por la presencia de los grupos fosfatos) lo que permite que migre del clo que permite que migre del cátodo (electrodo negativo) al ánodo (electrodo positivo).

 

Protocolo

 

Digestión de DNA con Enzimas de Restricción:

            1µL de buffer 10 X

            1µl de enzima (EcoRI)

            1µL de DNA

            7µL de H2O

            10µL de Volumen Total

Incubar a 37ºC por 30 hora

 

Preparación de muestras para la corrida:

            DNA sin cortar

                        1µL de DNA sin cortar

                        9µL de H2O

                        2µL de loading dye

            DNA cortado

                        10µL de digestión

                        2µL de loading dye

Corrida del Gel de Electroforesis:

1.      Prepara el gel de electroforesis 1% agarosa, calentando una mezcla que contiene 1g de agarosa y 100 mL de buffer TBE 1X, hasta que se disuelva la agarosa, déjala enfriar hasta aprox. 55ºC ó hasta que puedas tomar el matraz con la mano sin quemarte.

2.      Vierte la gel en un “gel holder” evitando la formación de burbujas de aire ya que estas pueden afectar la separación de las bandas del DNA.  Inserta la peinilla y deja la gel en un lugar seguro sin moverla hasta que polimerice completamente.

3.      Colocarlo en un tanque de electroforesis.  Añada suficiente buffer de electroforesis TBE 1X hasta que cubra el gel.

4.      Prepara las muestras de DNA, remueve la peinilla y coloca las muestras en las fosas usando una micropipeta.

5.      Coloque el gel en la cámara de modo que la muestras migren del cátodo (atrae cargas -) al ánodo (atrae cargas +).

6.      Conecte la cámara a un power supply y encienda a una razón de 10V por cada cm de gel.

7.      Deje migrar las muestras hasta que la línea del tinte se encuentre donde usted desee y apague el equipo.

8.      Deje teñir la gel en tinte.  Destiña por 30 min en agua si fuera necesario.

9.      Saque una fotografía del gel contra una fuente de luz UV.

10. Descarte el gel.

 

·        El "loading dye"que se utiliza contiene bromofenol azúl y glicerol.  El bromofenol azúl es un tinte que nos servirá para poder observar en la corrida por donde va el DNA, y el glicerol le da peso a la muestra evitando así que esta se salga de la fosa.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Resultados Esperados

 

Lamda DNA- 48502bp

 

Cortes con EcoRI                              Cortes con HindIII

21226                                                 23130

7421                                                                                                      9416

5804                                                                                                      6682

5643                                                                                                      4361

4878                                                                                                      2327

3530                                                                                                      2027

564

 

pGLu- 7831bp

Cortes con EcoRI                              Cortes con HindIII

4069                                                                                                      5146

3762                                                                                                      2685

 

 

1Kb Ladder

12216

11198

10180

9162

8144

7126

6108

5090

4072

3054

2036

1636

1018

517

506

396

344

298

220

201

154

134

75

 

 

 

Quiz #1

Laboratorio Enzimas de Restricción y Electroforesis de DNA

 

1.  Mencione 3 factores que afectan la actividad de las enzimas de restricción.  

     3pts

 

2.      Las enzimas de restricción de tipo II reconocen secuencias de DNA específicas y cortan fuera de esas secuencias.  Cierto o Falso.

     1 pto

 

3.      Mencione de que está hecho el gel de agarosa y el gel de poliacrilamida.  2pts

 

4.  Mencione un ejemplo de una enzima que genere terminales cohesivos y una    

     que genere terminales abruptos.  2pts

 

5.      Mencione 2 criterios para la separación de fragmentos en electroforesis.  2pts

 

 

Bono

Escriba la secuencia de DNA que reconoce la enzima SmaI